Ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στην ανάπτυξη αντιγονο-ειδικής θεραπείας της βαριάς μυασθένειας με ανοσοπροσρόφηση των αντι-υποδοχέα αντισωμάτων των μυασθενικών ασθενών
K. Κωστελίδου, Λ. Ψαρίδη-Λιναρδάκη, Ν. Τράκας, Α. Μαμαλάκη, Σ.Ι. Τζάρτος
ΣΚΟΠΟΣ Η παθολογία του αυτοάνοσου νοσήματος βαριά μυασθένεια οφείλεται στα παραγόμενα αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Η πλασμαφαίρεση αποτελεί μια σημαντική θεραπευτική αγωγή για τη μυασθένεια, αλλά απομακρύνει και πολύτιμα συστατικά του πλάσματος. Η εξωσωματική απομάκρυνση των αυτοαντισωμάτων με ανοσοπροσρόφηση σε υποδοχέα ακινητοποιημένο σε αδιάλυτο υπόστρωμα προσφέρει μια λύση, μολονότι η εφαρμογή αυτής της διαδικασίας για θεραπεία δυσχεραίνεται από την έλλειψη φυσικού υποδοχέα σε μεγάλες ποσότητες. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η παραγωγή ανασυνδυασμένων εξωκυτταρικών περιοχών των υπομονάδων του υποδοχέα και η χρήση τους ως ειδικών ανοσοπροσροφητών των αυτοαντισωμάτων των μυασθενικών για μελλοντική εφαρμογή σε ειδική θεραπεία της βαριάς μυασθένειας. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΣ Οι πρωτεΐνες εκφράστηκαν σε διαλυτή μορφή στο υπερκείμενο της καλλιέργειας του ζυμομύκητα Pichia pastoris, καθαρίστηκαν με τη χρήση Ni2+-NTA αγαρόζης και ελέγχθηκαν για τη διαλυτότητά τους με χρωματογραφία. Στη συνέχεια, αφού ακινητοποιήθηκαν σε CNBr-σεφαρόζη, χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα ανοσοπροσρόφησης με 64 ορούς μυασθενικών. Τα αντισώματα που παρέμειναν στον ορό μετά την ανοσοπροσρόφηση υπολογίστηκαν με τη μέθοδο του ραδιοανοσοπροσδιορισμού. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν οι εξωκυτταρικές περιοχές (αμινοξέα ~1-210) των α, β, γ και ε υπομονάδων του υποδοχέα. Κάθε ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη είχε δομή που προσομοίαζε με αυτή της φυσικής υπομονάδας που βρίσκεται στο μυϊκό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Ακινητοποιημένη α1-210 σε CNBr-σεφαρόζη, που χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοπροσρόφηση αντισωμάτων από τους ορούς των ασθενών, απομάκρυνε κατά μέσο όρο 35% των αντισωμάτων. Ακινητοποιημένες β1-221, γ1-218 και ε1-219 σε CNBr-σεφαρόζη χρησιμοποιήθηκαν στο ίδιο set των 64 ορών μυασθενικών και απομάκρυναν κατά μέσο όρο 22%, 21% και 18% των αυτοαντισωμάτων, αντίστοιχα. Συνδυασμός των α1-210 και γ1-218 σε πειράματα ανοσοπροσρόφησης με 10 ορούς έδειξε ότι τα πολυπεπτίδια δρουν αθροιστικά στην απομάκρυνση αυτοαντισωμάτων. Επώαση των πολυπεπτιδίων με ανθρώπινο πλάσμα έδειξε ότι τα ακινητοποιημένα πολυπεπτίδια δεν πρωτεολύονται και δεν ελευθερώνονται από το υπόστρωμά τους (σεφαρόζη). Η τιτλοδότηση της ανοσοπροσροφητικής στήλης με ορό έδειξε ότι μικρή ποσότητα (1 μg) ακινητοποιημένης πρωτεΐνης σε στήλη μπορεί να απομακρύνει τουλάχιστον 2 pmoles αντι-υποδοχέα αντισωμάτων. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η συνδυασμένη χρήση όλων των ανασυνδυασμένων εξωκυτταρικών τμημάτων των υπομονάδων αναμένεται να απομακρύνει την πλειονότητα των αυτοαντισωμάτων από τους περισσότερους ορούς μυασθενικών ασθενών, προσφέροντας έτσι τη δυνατότητα σχεδιασμού και εφαρμογής μιας νέας, αποτελεσματικής, αντιγονο-ειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια.
Λέξεις-κλειδιά: θεραπεία, Ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια, Ανοσοπροσρόφηση, Βαριά μυασθένεια, Υποδοχέας της ακετυλοχολίνης.
ΑΡΧΕΙΑ ΕΛΛΗΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ, 21(6), 546-555, 2004 - Ερευνητική εργασία