Τεχνικές ανίχνευσης του κερματισμένου DNA
Ρ. Αγγελοπούλου, Μ. Κυριαζόγλου
Οι τεχνικές εντόπισης των αποπτωτικών κυττάρων βασίζονται σε μορφολογικές παρατηρήσεις, βιοχημικές και ανοσοϊστοχημικές μεθόδους και στην ανίχνευση του κερματισμένου DNA in situ. Η τεχνική TUNEL [Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP Nick End Labeling], που χρησιμοποιείται συχνότερα, στηρίζεται στη σύνδεση του ενζύμου TdT με τα 3΄-OH άκρα των θραυσμάτων του DNA και στην προσθήκη βιοτινυλιωμένου νουκλεοτιδίου στις θέσεις εντομής. Παραλλαγή της μεθόδου είναι η τεχνική ISNT (In Situ Nick Translation), στην οποία χρησιμοποιείται το ένζυμο πολυμεράση Ι. Οι τεχνικές αυτές εφαρμόζονται σε τομές ψυκτικού μικροτόμου και παραφίνης. Για την επιτυχία της αντίδρασης πρέπει να αποφεύγονται οι παρατεταμένοι χρόνοι μονιμοποίησης, δεδομένου ότι ελαττώνουν την ευαισθησία. Παράγοντες σχετικοί με την αυτόλυση των ιστών, τη μονιμοποίηση, τη σκήνωση, το κόψιμο, την εξουδετέρωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης με Η2Ο2, τις διάφορες προεργασίες και, κυρίως, η νέκρωση μπορούν να προκαλέσουν «μη αποπτωτικό» κερματισμό του DNA. Η προετοιμασία των ιστών πριν από την αντίδραση περιλαμβάνει επεξεργασία στο φούρνο μικροκυμάτων ή και πρωτεόλυση με πεψίνη ή πρωτεϊνάση Κ. Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων είναι απαραίτητη η χρήση μαρτύρων και η πολυπαραμετρική προσέγγιση, π.χ. TUNEL και ευρήματα μορφολογικά ή ανοσοϊστοχημικά, για την ανίχνευση των σχετικών με την απόπτωση πρωτεϊνών, ή in situ υβριδισμός. Οι αντιοροί κατά της ενεργοποιημένης κασπάσης-3 προτείνονται ως ειδικοί δείκτες για την ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων, δεδομένου ότι κατά τη νέκρωση δεν παρατηρείται ενεργοποίηση των κασπασών. Η ανεξίνη V χρησιμοποιείται, επίσης, για την ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων, στον κυτταρομετρητή ροής, επειδή συνδέεται με τη φωσφατιδυλοσερίνη που έχει μετατοπιστεί στο εξωτερικό πέταλο της κυτταρικής μεμβράνης, κατά τη διάρκεια της αποπτωτικής διεργασίας. Η μετατόπιση της φωσφατιδυλοσερίνης προηγείται του κερματισμού του DNA και, συνεπώς, επιτρέπει την ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων στα αρχικά στάδια της διεργασίας. Με την τεχνική comet ανιχνεύεται το κερματισμένο DΝΑ σε μεμονωμένα κύτταρα, με ηλεκτροφόρηση. Ονομάζεται έτσι λόγω του χαρακτηριστικού σχήματος που παρατηρείται, σε περίπτωση μεγάλης έκτασης βλάβης, κατά την έξοδο του κερματισμένου DΝΑ από τον πυρήνα και το κύτταρο και τη μετανάστευσή του προς την άνοδο. Το βασικό πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι μετρά την απάντηση στη βλάβη του DΝΑ σε μεμονωμένα κύτταρα και, συνεπώς, επιτρέπει τη μελέτη της ετερογένειας ενός δεδομένου κυτταρικού πληθυσμού. Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από τις προαναφερθείσες τεχνικές επιτρέπει την ποσοτικοποίηση του κερματισμένου DΝΑ και παρέχει ένα πληρέστερο συμπέρασμα για την κατανόηση της αποπτωτικής διεργασίας και της ανταπόκρισης του κυττάρου στη βλάβη του DΝΑ.
Λέξεις-κλειδιά: Aπόπτωση, Kασπάσες, Κερματισμένο DNA, Comet, TUNEL.
ΑΡΧΕΙΑ ΕΛΛΗΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ, 19(2), 167-178, 2002 - Εργαστηριακές τεχνικές